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Bio-Rad_iCycler iQ熒光定量PCR儀的操作技巧與使用心得分享
更新時間:2025-03-06   點擊次數(shù):337次
   Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀是分子生物學(xué)實驗室的常用設(shè)備,其精準(zhǔn)的溫度控制和靈敏的光學(xué)檢測系統(tǒng)為基因表達分析、SNP分型等研究提供了可靠保障。要充分發(fā)揮這臺儀器的性能,需要掌握一些關(guān)鍵的操作技巧。
 
  在實驗準(zhǔn)備階段,耗材的選擇至關(guān)重要。推薦使用低吸附的PCR管或96孔板,并確保管蓋閉合。反應(yīng)體系的配制需要在冰上進行,各組分要充分混勻。引物和探針的濃度需要優(yōu)化,通常引物終濃度為0.2-0.5μM,探針終濃度為0.1-0.2μM。模板DNA的加入量建議在1-100ng之間,過高可能導(dǎo)致擴增效率下降。
 
  程序設(shè)置是實驗成功的關(guān)鍵。退火溫度需要根據(jù)引物的Tm值確定,通常比Tm低3-5℃。延伸時間根據(jù)擴增片段長度設(shè)置,一般按每分鐘延伸1kb計算。建議設(shè)置熔解曲線分析步驟,以驗證擴增特異性。對于多重PCR,需要仔細優(yōu)化各通道的熒光采集溫度,避免信號干擾。
 
  數(shù)據(jù)分析時,要正確設(shè)置基線范圍和閾值線?;€通常選擇3-15個循環(huán),閾值線設(shè)置在指數(shù)擴增期的線性范圍內(nèi)。對于相對定量,需要選擇合適的內(nèi)參基因,并使用ΔΔCt法計算目標(biāo)基因的相對表達量。絕對定量則需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,確保擴增效率在90%-110%之間。
 
  儀器維護不容忽視。每月清潔樣品槽和光學(xué)系統(tǒng),使用無水乙醇擦拭樣品槽,用鏡頭紙清潔光學(xué)元件。每季度校準(zhǔn)溫度控制系統(tǒng),使用專用校準(zhǔn)試劑盒驗證各孔溫度準(zhǔn)確性。每年進行全面的光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn),確保熒光檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。
 
  掌握這些操作技巧,就能充分發(fā)揮Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀的性能,獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)。隨著使用經(jīng)驗的積累,實驗人員還能根據(jù)具體研究需求,開發(fā)出更優(yōu)化的實驗方案。
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